[VIP第1年] 指数:3
目前市场上**成功的商业化多重PCR建库技术是ThermoFisher公司的Ampliseq技术，该技术可以在同一孔反应中完成上千对引物的扩增，使得多个靶标区域的富集可以通过一次PCR反应完成，随后加上IonTorrent测序平台的通用接头建好文库用于二代测序。然而，这个产品存在**大的缺陷是客户定制化的panel设计生产周期较长，需要两到三个月，重庆个性化迈杰转化医学NGS平台来电咨询，严重的增加了时间成本；并且每个样本的建库费用高达1000-2000元，致使其经济成本极高；另外该试剂盒只适用于IonTorrent测序平台，受平台因素影响大，亦不利于测序费用的降低。技术实现要素：鉴于以上问题，本发明提供了一种基于多重PCR的二代测序建库技术，该技术可以有效的解决Ampliseq试剂盒存在的问题，对于客户定制化的panel设计生产周期只需要两周，并且可以极大的降低单个样本建库的成本，且在IonTorrent和Illumina测序平台都通用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明中用到了两轮多重PCR来建库，重庆个性化迈杰转化医学NGS平台来电咨询。首先针对每个靶标区域或者靶标位点，需要设计两条特异性引物，一条引物在另一条引物的3’下游100-150bp的位置，重庆个性化迈杰转化医学NGS平台来电咨询，处于下游的引物在5’端加上二代测序平台通用的测序接头。上游的引物OP用于***轮多重PCR。迈杰转化医学为全球合作伙伴提供包括生物标记物挖掘、药物靶点验证、伴随诊断开发等一体化解决方案。重庆个性化迈杰转化医学NGS平台来电咨询
既节约时间又降低测序成本。目前，基于法庭科学领域运用**多的ngs系统为illumina公司的miseqfgxtm系统和thermofisher公司的iontorrentpgmtm系统，但针对以上平台的二代测序商业化str分型试剂盒的研发尚处于起步阶段，主要有powerseqautosystem(promega，madison，wi,usa)、forenseqtmdnasignatureprepkit(illumina，sandiego，ca，usa)和precisionidglobalfilerngsstrkit(termofisher，waltham，ma，usa)。但以上试剂盒涉及的y-str相对较少，三个试剂盒分别包含了1个y-str基因座、26个y-str基因座、2个y-str基因座。同时存在试剂盒价格昂贵，配套的数据分析软件只能针对各自开发试剂盒，参数的设置相对固定，只能对固有基因座的测序数据进行分析，不利于法医学实际应用。因此，构建一种适用于当前主流二代测序检测平台miseqfgxtm系统及开放性测序数据分析软件straitrazor、myflq等，且能容纳更多y-str基因座的复合扩增体系具有一定的意义。技术实现要素：本发明的目的是制备检测更多y-str基因座的试剂盒，提高了父系亲缘关系分析能力和鉴定效能。本发明首先保护引物组合，可包括引物1—引物120；引物1—引物120均为单链dna分子，核苷酸序列依次可如seqid**—seqid**20所示。 重庆个性化迈杰转化医学NGS平台来电咨询PMS2抗体试剂 苏苏械备20180570号.
1、Illumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像主要步骤：①DNA文库制备——超声打断加接头②Flowcell——吸附流动DN**段③桥式PCR扩增与变性——放大信号④测序——测序碱基转化为光学信号优势劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。2、Roche454油包水PCR+4种dNTP车轮大战+检测焦磷酸水解发光主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油**PCR③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号优势劣势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。3、IonTorrent原理油包水PCR+4种dNTP车轮大战+微电极PH检测主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油**PCR③微电极pH检测——磁珠入池记录pH优势劣势：IonTorrent与454相比，主要差异在测序中，IonTorrent不需要昂贵的物理成像设备，成本相对较低体积较小。
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒及其使用的引物组合，尤其涉及基于二代测序技术检测67个y-str基因座和amelogenin基因座的试剂盒及其使用的引物组合。背景技术：短串联重复(shorttandemrepeat，str)是由2～6bp重复单位串联组成且***存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的dna序列，是目前法医个体识别和亲子鉴定应用*****的遗传标记。人类y染色体短串联重复(y-chromosomeshorttandemrepeats，y-str)具有父系遗传、缺乏重组、分型简单、信息量大、多态性高等特点，是研究人类的起源进化、民族差异、种族差异、群体及地区分布等的有力工具。因此，y染色体str基因座多态性研究可为法医学个体识别和亲权鉴定提供重要手段，在诸如父系家族的亲权鉴定、混合斑男性成分的检测、不同男性个体混合物的分析、追溯父系迁移历史及重构同一父系家族等方向都具有独特的应用价值。目前，荧光标记多重扩增结合毛细管电泳(fluorescentlabeledmultiplexpcr-capillaryelectrophoresis，pcr-ce)是str分型的主流技术；常用的商业化y-str分型试剂盒有y23(promega)、y(promega)、yfiler(thermofisherscientific)和yfilerplus。迈杰转化医学为生物标志物研究和伴随诊断开发提供科学支持，多层面助力新药研发临床试验。
为了展现并比较以上几种测序方法技术方面的不同，给所有人，鼠，拟南芥和大肠杆菌基因组测序时，每个测序产生的覆盖数量都会在这里计算和展示。展示的数据都是来自于每种技术强大的仪器。全基因组测序时，为使数据有效，**少需要30x的覆盖面。就像大家看到的，焦磷酸测序法只能给大肠柑橘基因组测序，并且需要足够的覆盖面来产生有效的数据。RUROLimfinityNGS是适用于二代测序全流程的信息管理平台，包含您提到的样本前处理、样本接收、处理、样本存储、文库制备、测序、完成以及质控等全流程信息管理，实现了真正意义上样本全生命周期的管理，并且符合21CFRPart11电子签名的规定1.不要删除或篡改试验数据2.不隐藏不良的检验结果3.了解并符合审查审计追踪。作者：Siri链接：源：知乎著作权归作者所有。商业转载请联系作者获得授权，非商业转载请注明出处。 迈杰转化医学针对药物研发过程中靶点、适应症及PD研究中生物标志物等研究的进行方案开发设计。上海标准迈杰转化医学NGS平台值得推荐
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PacBio平台技术关键DNA聚合酶，该技术得到的序列读长主要跟DNA聚合酶的活性有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。荧光基团标记在核苷酸3'端磷酸上，在DNA合成过程中，3'端的磷酸键随着DNA链的延伸被断开，标记物被弃去，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。ZMW(零模波导孔)，将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景进行区分，在一个反应管中有许多这样的圆形纳米小孔，其外径*有100nm，激光从底部打出后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围里，使得荧光信号*来自这个小反应区域，孔外其它游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景荧光降到比较低。PacBio平台技术优势1.近乎完美的一致性和准确性三代测序单碱基错误率虽然很高，但是这种单碱基的错误是随机发生的，因此，对同一段序列测序覆盖多次就能够进行纠错，一般覆盖到10X以上的深度就能达到。2.不存在测序的偏好性因为SMRT技术在样本制备时无需PCR扩增，对于某些具有极端的碱基组成的核酸区域，三代测序也是无偏好性的，同时也不受回文序列的影响。3.序列准确比对二代测序得到的序列由于长度不够，在进行比对时，会出现很多错误匹配，从而造成假阳性SNP位点。 重庆个性化迈杰转化医学NGS平台来电咨询
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